دانلود رایگان


کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم - دانلود رایگان



دانلود رایگان پروتئازها از مهم ترین آنزیم های صنعتی هستند که حداقل یک چهارم تولیدات آنزیمی در سطح جهان را به خود اختصاص داده اند و بطور گسترده در صنایع مختلف از جمله موا

دانلود رایگان
کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنسپروتئازها از مهم ترین آنزیم های صنعتی هستند که حداقل یک چهارم تولیدات آنزیمی در سطح جهان را به خود اختصاص داده اند. سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند. این آنزیم یک متالوپروتئاز حاوی روی است و شامل ۴۷۰ اسید آمینه و جرم مولکولی50632 دالتون می باشد و در درمان تورم پس از ضربه و بیماری های پستان فیبروسیس و برونشیت بسیار مفید می باشد.
در این مطالعه ابتدا جداسازی سراشیا مارسسنس مولد آنزیم سراپپتیداز صورت گرفت و توالی ژن سراپپتیداز از بانک ژنی NCBI بدست آمد و طراحی پرایمر صورت گرفت. پس از استخراج DNA ژنومی باکتری سراشیا مارسسنس به روشBoiling ، به عنوان الگو در تکثیر PCR مورد استفاده قرار گرفت و پس از تایید محصول PCR، ژن تکثیر یافته در وکتور TA کلون و سپس درون وکتور بیانی PET28 ساب کلون گردید .کلون انجام شده توسط برش آنزیمی، PCRو تعیین توالی تایید شد و پلاسمید نوترکیب با آنزیم Nde1 و Xho1 خطی شده وE.coli سویه BL21 توسط وکتور نوترکیب ترانسفورم و بیان پروتئین تحت القایIPTG و الکتروفورزSDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت و با استفاده از ستون کروماتوگرافی نیکل-سفارز آنزیم مورد نظر تخلیص گردید.
آنزيم داراي pH بهينه 7 و دماي بهينه 55 درجه است. با رسم نمودار Michaelis-Menten محاسبه Km و Vmax صورت گرفت. مقادير km و Vmax براي سوبستراي کازئین به ترتيب mM 04/0 و((mM/min 177/0 مي باشد.
کلونینگ، بیان و تخلیص و تعیین ساختار ژن سرپپتیداز در این مطالعه تایید می شود. این پروتئین نوترکیب می تواند در مطالعات آینده در صنایع دارویی مورد استفاده قرار گیرد.
كلمات كليدي:
پروتئاز، سراپپتيداز، كلونينگ، بيان، تخليص، فعاليت، پايداري ، سراشيا مارسسنس
فهرست مطالب
عنوان شماره صفحه
چکیده
فصل اول : کلیات
1-1مقدمه2
1-2 بیان مسئله، اهمیت و ضرورت تحقیق5
1-2-1 آنزیم ها 5
1-2-2 غربالگري screeningآنزيم ها واهميت آن 6
1-2-3 منابع آنزيمي 7
1-2-3-1 ميکروارگانيزم ها به عنوان عمده ترين منابع آنزيمي 7
1-2-3-2 موقعيت تاکسونوميک توليد کننده هاي شناخته شده آنزيمي 8
1-2-3-3 ميکروارگانيسم هايGRAS 8
1-2-4 کلکسيونهاي ميکروب (Culture Collection)به عنوان منابع ميکروارگانيسم ها 9
1-2- 5 بازار جهانی آنزیم 10
1-2-6 پروتئازها 11
1-2-6-1 اعمال پروتئازها 12
1-2-6-2 دسته بندی پروتئازها 17
1-2-7 کاربرد پروتئازها 22
1-2-7-1 صنعت شوینده 22
1-2-7-2 صنعت چرم 23
1-2-7-3 صنایع دارویی 24
1-2-7-4 صنایع غذایی 25
1-2-8 سراشیا مارسسنس 26
1-2- 9 سراشیاپپتیداز و اهمیت آن 28
1-2-10 روشهاي DNA نوترکيب و اهميت آن 29
1-2-11 انتخاب ميزبان بيان ژن 30
1-2- 12راهبردهاي نسخه برداري (انتخاب حاملين بيان ژن) 31
1-2-13 سيستم بيانpET 32
1-2-14استراتژي خالص سازي محصول نوترکيب 34
هدف از انجام پروژه 36
فصل دوم: پیشینه پژوهش
2-1 ادبیات و سوابق مربوطه39
فصل سوم: روش شناسی
3-1مواد شيميايي 42
3-2 ميكروارگانيسم ها ومحيط هاي كشت مورد استفاده 43
3-2-1 ميكروارگانيسم ها و پلاسميدها 43
3-2-2محيط هاي كشت ميكروبي 44
3-3 روش سنجش فعالیت پروتئاز 45
3-4 مطالعات اولیه آنزیم شناسي 46
3-4-1 اثر دما بر پايداري آنزيم 46
3-4-2 اثر pH بر پایداری آنزیم 46
3-4-3 دماي بهينه 47
3-4-4 تعيين پارامترهاي سينتيكي آنزيم 47
3-5 جداسازي باکتري 48
3-5-1 استخراج DNAژنومي 48
3-5-2 طراحی پرايمر و انجام PCR 48
3-5-2-1 مراحل PCR 49
3-5-3 کلون سازی ژن سراپپتیداز در وکتورT/A 50
3-5-4 رسم درخت فیلوژنتیک 51
3-5-5 تعیین توالی ژن کدکننده سراپپتیداز 51
3-6 روشهای الکتروفورزی 53
3-6-1 SDS-PAGE 53
3-6-2 الکتروفورز ژل آگارز(100) 53
3-7 فنون مربوط به DNA نوتركيب 54
3-7-1 ساختار ناقل كلونينگ 54
3-7-2 آماده سازي قطعهDNA براي انتقال به درون وكتور 55
3-7-3 استخراج DNA از روي ژل 56
3-7- 4 مراحل کلون مجدد 56
3-7-5 مستعدکردن باکتري DH5αبه روش استفاده از محلول CaCl2 (M 1/0) 58
3-7-6 انتقال محصول الحاق به درون باکتري مستعدDH5α 59
3-8 بافرCracking 60
3- 9بيان ژن سراپپتیداز و تعيين خلوص آن توسطSDS-PAGE 62
3-9-1 القاء باکتري و بيان پروتئين هاي نوترکيب 62
3-9-2 بررسي بيان پروتئين هاي نوترکيب با استفاده از روش الکتروفورز 63
3-10 تخليص پروتئين هاي نوترکيب 66
3-10-1 بافرهاي موردنياز تخليص پروتئين نوترکيب 66
3-10-2 روش تخليص پروتئين نوترکيب 67
فصل چهارم: تجزیه وتحلیل داده ها
4-1 جداسازي باکتري 70
4-2 استخراج DNAژنومي 70
4-3 رسم درخت فیلوژنتیکی 70
4-4 کلون کردن ژن سراپپتیداز در حامل بيانيpET28-a (+) 71
4-5 بيان و تخليص ژن سراپپتیداز نوترکيب 75
4-6 منحني استاندارد 77
4-7 اثر pH روي فعاليت آنزيم 77
4-8 دماي بهينه آنزيم 78
4 -9 بررسی خصوصویات کاتالیتیک آنزیم79
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-1 نتیجه گیری نهایی 88
5-2 پیشنهادات 88
منابع و مأخذ 89
فهرست منابع انگلیسی89
فهرست جداول
عنوان شماره صفحه
جدول 3-1 خصوصیات انواع سویه ها و پلاسمیدهای مورد استفاده در پژوهش 43
جدول 3-2 نسبت های واکنش الحاق 57
فهرست اشکال
عنوان شماره صفحه
شکل 1-1 سیستم بیان pET ......................................................................................................................34
شکل 2-1 ناقل کلونینگPet28a...............................................................................................................55
شکل 4-1 درخت فیلوژنتیکی رسم شده با استفاده از NCBI....................................................................71
شکل 4-2 الکتروفورز محصول واکنش PCR.............................................................................................72
شکل 4-3 الکتروفورز پلاسميد هاي استخراج شده از باکتریهای ترانسفورم شده توسط روش Cracking..................................................................................................................................................73
شکل 4-4 نمونه های پلاسمیدی حاوی ژن.................................................................................................74
شکل 4-5 محصول واکنش PCR...............................................................................................................75
شکل 4-6 ژل الکتروفورز آنزیم تخلیص شده ............................................................................................76
فهرست نمودارها
عنوان شماره صفحه
نمودار 4-7 منحنی استاندارد غلظت تیروزین .............................................................................................77
نمودار 4-8 تأثیر pH بر روی فعالیت سراپپتیداز ........................................................................................78
نمودار 4-9 اثر دما بر روی فعالیت سراپپتیداز ............................................................................................79
نمودار 4-10 منحنی میکائیلیس-منتن از فعالیت پروتئازی .........................................................................80
فصل اول
کلیات
مقدمه
پروتئازها از مهم ترین آنزیم های صنعتی هستند که حداقل یک چهارم تولیدات آنزیمی در سطح جهان را به خود اختصاص داده اند و بطور گسترده در صنایع مختلف از جمله موادغذایی، موادشوینده، داروسازی، چرمسازی و... مورد استفاده قرار می گیرند (Ghaemi et al, 2005). از جمله موارد حائزاهمیت کمبود این آنزیم، قليايي شدن بيش از حد خون مي باشد بطوريكه قلیایی شدن این محیط باعث اضطراب و بی خوابی می شود وهم چنین کمبود آن سبب ورم مفاصل و پوکی استخوان ودیگر بیماری های کمبود کلسیم می شود. از آنجایی که پروتئین تبدیل به گلوکز می شود و هضم پروتئین ناکافی منجر به هیپو گلیسمی می شود. با توجه به مطالب فوق از میان پروتئازهای میکروبی، سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند و پزشکان در سراسر اروپا و آسیا مزایای ضد التهابی و ضد درد این ماده را به رسمیت شناخته اند و از آن به عنوان جایگزین سالیسیلات ها، ایبوپروفن و سایر داروهای ضد درد غیراستروئیدی در درمان استفاده می شود ( Mazzone ,1990).
منابع توليد آنزيمها بسيار متنوع است. بطوریکه از صد ها آنزیمی که بطور تجاری استفاده می شود بیش از نیمی از آنها از قارچ و مخمر و بیش از یک سوم آنها از باکتری ها و باقی مانده از گیاهان و حیوانات حاصل می شود. بنا به دلايل زير ميکروبها به عنوان منابع آنزيمي نسبت به گياهان و جانوران ترجيح داده مي شوند:1- عموما توليد آنها ارزانتر است 2- آنزيمهاي حاصل از آنها قابل پيش بيني و قابل کنترل تر هستند، 3- بافتهاي گياهي و جانوري نسبت به میکروارگانیسم ها مواد مضر بيشتري دارند (مانند ترکيبات فنلي در گياهان، مهارکننده هاي داخل سلولي و پروتئازها)، 4- نسبت به گياهان و جانوران راحت تر مي توان ميکروب ها را از نظر ژنتيکي دستکاري نمود، 5- ميکروارگانيزم ها را مي توان در مقادير بالا و در يک مدت زمان نسبتا کم از طريق روشهاي تخمير کشت داد 6- پروتئين هاي ميکروبي اغلب نسبت به همتاهاي جانوري و گياهي خود پايدارترند. 7-منابع قابل اعتمادی از مواد اولیه جهت رشد آنها به راحتی فراهم میشود. بطور کلی می توان گفت محدودیت تولید آنزیم های حیوانی و گیاهی از یک سو و تولید ناکافی این منابع برای پاسخ به در خواست جهانی تولید آنزیم و توجه را به سوی آنزیم های میکروبی معطوف کرده است (Kroner, 1984).
امروزه آنزیم ها در صنایع مختلف کاربردهای فراوانی دارند بطوریکه در سال ۲۰۰۰ بازاری معادل ۱.۵ بیلیون دلار آمریکا صرف خرید آنزیم برای استفاده در صنایع گوناگون شده است. از میان آنزیم ها آنزیم هایی که نقش هیدرولیز کننده دارند مانند پروتئازها، آمیلاز، استراز و لیپازها حائز بیشترین اهمیت می باشد. در این میان ۴۰٪ از سهم فروش سالیانه آنزیمی (معادل ۱۳۰۰-۱۵۰۰تن در سال) مربوط به پروتئازها می باشد. پروتئازها در صنایع گوناگون کاربرد دارند. بخش عمده ای از کاربرد آنها در شوینده ها به عنوان افزودنی و مابقی در صنایع غذایی، دارویی، چرم و تشخیص پزشکی استفاده می شود (Gupta, 2004). از میان پروتئازهای میکروبی، سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند که این آنزیم هم چنین با نام های سرالیزین و سراشیاپپتاز و سراشیو پپتیداز شناخته می شود. سراپپتیداز متالوپروتئاز حاوی روی خارج سلولی و شامل ۴۷۰ اسید آمینه و با جرم مولکولی63250 دالتون می باشد که توسط انتروباکتریوم سراشیا غیر پاتوژن E15 تولید می شود. این میکروارگانیسم در ابتدا در اواخر ۱۹6۰ از روده کرم ابریشم جدا شد (Hase& Finkelstein , 1993).
این آنزیم به دلیل توانایی آن در درمان انسداد شریانی در بیماران مبتلا به بیماری عروق کرونر به عنوان آنزیم معجزه توصیف می شود (Raskin, 1999). سراپپتیداز دارای خواص ضد التهابی قوی و در درمان تورم پس از ضربه و بیماری های پستان فیبروسیس و برونشیت بسیار مفید است. کاهش درد از دیگر ویژگی های آن است که علت آن توانایی در جلوگیری از آزاد شدن آمین ها یا القاکننده درد از بافتهای ملتهب است (Mazzonie et al, 1990). بنابراین با توجه به مزایای فوق میتوان ازآن به عنوان یک آنزیم دارویی استفاده کرد.
1-2 بیان مسئله و ضرورت تحقیق
1-2-1 آنزیم ها
موجودات زنده به لحاظ دارا بودن کاتالیزورهای زیستی که اصطلاحا آنزیم نامیده می شوند، قادر به کسب انرژی از محیط و مصرف سریع آن می باشند. همچنانکه در مورد کاتالیزورهای معدنی مشاهده می شود. آنزیم ها قادر به تسریع واکنش های شیمیایی بوده ولیکن در تعادل نهایی شرکت نمی کنند. برخلاف کاتالیزورهای معدنی، آنزیم هادارای دامنه عمل بسیار ظریفی هستند و در مقایسه، دامنه بسیار محدودی از مواد را کاتالیز می کنند و یا اینکه در بعضی موارد تنها یک واکنش را کاتالیز می کنند. آنزیم ها بنا به تعریف در شرایط خاصی از pH، درجه حرارت و غلظت سوبسترا بهینه فعالیت دارند و ممکن است به کوفاکتورهای ویژه ای نیاز داشته باشند.
آنزيم ها بر حسب نوع واكنشي كه انجام مي دهند به 6 گروه اصلي تقسيم بندي می شوند:
اكسيدوردوكتازها
ترانسفرازها
هيدرولازها
ليازها
ايزومرازها
ليگازها
1-2-2 غربالگري ((screening آنزيم ها و اهميت آن
با غربالگري ارگانيسم ها به منظور فعاليت هاي بيوكاتاليزي مختلف، می توان محصولات توليد شده توسط آنها را كه نسبت به وظايف خود در خلال فرايند تكامل سازش يافته اند به دست آورد.بنابراين غربالگري از جنبه هاي مختلف يك سرمايه گذاري مناسب محسوب مي گردد (Dalboge& Dalboge,1998). غربالگري بيوكاتاليست هاي جديد با اهداف آكادميك و علوم پايه و يا به منظورهاي كاربردي-صنعتي صورت مي گيرد (Xuyang et al, 1995). منابع توليد كننده آنزيم ها بسيار متعدد هستند. اما ميكروارگانيسم ها بنا به دلايلي كه به آنها اشاره خواهد شد مهمترين و عمده ترين منبع توليد كننده آنزيم ها هستند كه مد نظر مي باشند. فرآيند هاي اوليه در تحقيقات و به دست آوردن يك انتخاب و غربالگري محصول آنزيمي مي باشند. جستجو به منظور يافتن يك ژن كد كننده ويژه براي آنزيم هدف، داراي اهميت ویژه است. در گذشته اين فرآيند منحصرا شامل غربالگري ميكروارگانيسم هاي زنده بود. (غربالگري ميكروبي كلاسيك). اما با بكار گيري روش هاي نوین بيولوژي مولكولي، غربالگري بدون نياز به كشت ارگانيسم ها قابل انجام مي باشد (Richardson et al, 2002 ). البته هر روشي داراي محدوديت هايي است و تركيبي از تكنيك ها (combinational screening) اغلب بسيار موفقيت آميز است (Aehle, 2004). براي شروع فرآيند جستجو و كشف، تنوع عظيم از ميكروارگانيسم ها در طبيعت بهترين مژدگاني است (Kristjansson&Gudmundur, 1995).
تنوع متابوليکي به وجود آمده در 85% از تاريخ زمين که حيات محدود به ميکرو ارگانيسم ها است واقعا شگفت انگيز است. در غربالگري جمع آوري نمونه ها از منابع طبيعي مي تواند بدون هيچ تمايزي صورت گيرند (مثل نمونه هاي خاک) يا شرايط اکولوژيک در اين بررسي مورد توجه قرار گيرد و يک جستجوي هدفدار از يک زيستگاه خاص و ويژه که احتمال يافتن يک فعاليت آنزيمي يا يک خصوصيت آنزيمي ويژه در آن وجود دارد انجام شود. در صورتيکه منابع مورد جستجو و کاوش قبلا کمتر مورد بررسي قرار گرفته باشند و يا جديدا کشف شده باشند، احتمال دستيابي به تنوع بيشتر ژنومي و استخراج ميکروب هاي جديد (novel) بسيار افزايش مي يابد. در کنار موارد فوق راهکارهايي که بر اساس تاکسونومي مي باشد و شامل بررسي سيستماتيک از ارگانيزم هاي شناخته شده است نيز مي تواند موفقيت آميز باشد. امروزه غربالگري با تکنيک هاي جديد نظير تکامل جهت یافتهدستيابي به فعاليت هاي جديد، خصوصيات جديد و بهبود بيوکاتاليست ها از جنبه هاي مختلف، همچنين پي بردن به مکانيسم هاي دخيل در آنها شتاب بيشتري گرفته است (Ashie , 2003) و (Bronscheuer& Pohl, 2001 ).




دریافت فایل
جهت کپی مطلب از ctrl+A استفاده نمایید نماید




کلونینگ


بیان، تخلیص و بررسی


فعالیت آنزیم سراپپتیداز


ز سراشیا مارسسنس


دانلود پایان نامه


word


مقاله


پاورپوینت


فایل فلش


کارآموزی


گزارش تخصصی


اقدام پژوهی


درس پژوهی


جزوه


خلاصه